STAT3 Mutacje w zespole hiper-IgE cd

Kompletne dane mikromacierzy są dostarczane wraz z analizami w tabelach 1, 2, 3, 4 i 5 Dodatku Uzupełniającego. Surowe dane są dostępne na stronie internetowej Gene Expression Omnibus (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) pod numerem dostępu GSE8507. Wizualizowaliśmy implikowane ścieżki biochemiczne przy użyciu oprogramowania Ingenuity Pathways Analysis (Ingenuity Systems). Cytokiny
Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej wytworzono przy użyciu wirowania w gęstości z heparynizowanej krwi pełnej, jak opisano wcześniej. Komórki stymulowano przez 48 godzin w 37 ° C w 5% dwutlenku węgla za pomocą fitohemaglutyniny (1: 100), fitohemaglutyniny z interleukiną. 12 (10 ng na mililitr), lipopolisacharyd (200 ng na mililitr), lipopolisacharyd z interferonem-. (1000 IU na mililitr) lub interleukina-6 (40 ng na mililitr). Supernatanty zebrano i przechowywano w temperaturze -20 ° C do momentu, w którym poziomy cytokin można było zmierzyć za pomocą metod opartych na płytkach (Meso Scale Discovery) lub metodach opartych na kulkach (BioRad Luminex), zgodnie z zaleceniami producentów. Poziomy cytokin porównywano z zastosowaniem testu U Manna-Whitneya (oprogramowanie GraphPad), przy czym wartości P mniejsze niż 0,05 uważano za wskazujące na istotność statystyczną.
Sekwencjonowanie
Komplementarny DNA (cDNA) wytworzono z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej i neutrofili niespokrewnionych probandów i osobników kontrolnych i zsekwencjonowano dla przekaźnika sygnału i aktywatora genu transkrypcji 3 (STAT3) (listę starterów, patrz Metody w Dodatku Dodatek). Sekwencjonowanie przeprowadzono na sekwenserze Applied Biosystems 3100 i analizowano za pomocą oprogramowania Sequencher (Gene Codes). Zsekwencjonowaliśmy również cDNA z leukocytów krwi obwodowej lub transformowanych limfoblastoidalnych linii komórkowych lub genomowego DNA krewnych. Do sekwencjonowania genomowego DNA, startery reakcji łańcuchowej polimerazy (dostępne w dodatkowym dodatku) wybrano zgodnie z mutacją probanda. GenBank rozpoznaje trzy ludzkie izoformy STAT3: NP_644805.1, NP_003141.2 i NP_998827.1. Przedstawione tutaj pozycje aminokwasów dotyczą izoform NP_644805.1.
Cytometria przepływowa do wykrywania fosforylowanego STAT3
Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej zdrowych osób dorosłych lub pacjentów z zespołem hiper-IgE izolowano za pomocą gradientu Ficolla. Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (1 x 106) inkubowano w 100 .l soli fizjologicznej buforowanej fosforanem z 2% surowicą płodową, bez bodźca lub z interleukiną-6 (10 ng na mililitr) (R & D Systems), dla 25 lub 60 minut. Komórki utrwalono, permeabilizowano i barwiono, jak opisano wcześniej.15 Do zidentyfikowania wewnątrzkomórkowego lub wewnątrzjądrowego fosfo-STAT3 użyto skoniugowanego przeciwciała Alexa Fluor 647 fosfo-STAT3 przeciw fosfo-S727 (BD Biosciences). Mysie IgG1 (BD Biosciences) zastosowano jako kontrolę izotypową. Analizę przeprowadzono na cytometrze przepływowym FACSCalibur (BD Biosciences) z oprogramowaniem Cell Quest (BD Biosciences).
Bioinformatyczna analiza zmian bodźców w STAT3
W przypadku wykrytych zmian w błędach użyliśmy metod bioinformatycznych zakodowanych w programach Sortowanie nietolerancyjne z tolerancyjnym (SIFT) 16 i PolyPhen.17 SIFT zgłasza prawdopodobieństwo, że podstawienie jest szkodliwe, przewidując, czy podstawienie jest lub prawdopodobnie nie jest szkodliwe
[patrz też: krew oddawanie, chirurgia dziecięca warszawa, akupunktura cena ]