Lokalne odnowienie dystrofiny za pomocą antysensownego oligonukleotydu PRO051 czesc 4

W przypadku pozostałych trzech pacjentów fibroblasty przekształcono w komórki miogenne po zakażeniu wektorem adenowirusowym zawierającym gen miogennego czynnika transkrypcyjnego (MyoD), jak opisano wcześniej.19,24,25 Hodowle Myotube transfekowano PRO051 (100 nM) i polietylenoiminą. (2 .l na mikrogram PRO051), zgodnie z instrukcjami producenta ExGen500 (MBI Fermentas). RNA wyizolowano po 48 godzinach. Przeprowadzono reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkryptazą (RT-PCR), immunofluorescencję i analizę Western blot, jak opisano wcześniej.19,23 fragmentów PCR analizowano przy użyciu 2100 Bioanalyzer (Agilent) i wyizolowano do sekwencjonowania za pomocą Leiden Genome Technology Centrum. Ocena bezpieczeństwa
Na początku badania i po 2 godzinach, dniu i 28 dniach po wstrzyknięciu wszyscy pacjenci otrzymali pełne badanie fizykalne (w tym pomiar parametrów życiowych) i przeszli elektrokardiografię. Ponadto, osocze i mocz uzyskano w celu określenia czynności nerek i wątroby, poziomu elektrolitów, całkowitej liczby komórek, czasu częściowej tromboplastyny po aktywacji oraz wartości aktywności dopełniacza w klasycznych (CH50) i alternatywnych (AP50). Zaaplikowano jednoczesne stosowanie leków. W punkcie wyjściowym i 28 dniu oceniano siłę mięśnia piszczelowego przedniego za pomocą skali Medical Research Council26 w celu oceny, czy procedury wpłynęły na sprawność mięśni. (W tej skali wynik 0 oznacza brak ruchu, a wynik 5 oznacza prawidłową siłę mięśni.) Ponieważ tylko niewielka część mięśnia była leczona, nie oczekiwano klinicznej korzyści pod względem zwiększenia siły mięśni. Podczas każdej wizyty rejestrowano zdarzenia niepożądane.
Ocena RNA
Szeregowe wycinki (50 .m) zamrożonej próbki z biopsji mięśni homogenizowano w roztworze RNA-Bee (Campro Scientific) i MagNA Lyser Green Beads (Roche Diagnostics). Całkowity RNA wyizolowano i oczyszczono zgodnie z instrukcjami producenta. W przypadku komplementarnego DNA, przeprowadzono syntezę z odwrotną transkryptazą transkrypcyjną (Roche Diagnostics) z użyciem 500 ng RNA w 20 .l reakcji w 55 ° C przez 30 minut z ludzkimi eksonowymi 53 lub 54 specyficznymi starterami wstecznymi. Analizy PCR przeprowadzono jak opisano wcześniej. 19,23 Produkty analizowano na 2% żelu agarozowym i sekwencjonowano. Dodatkowo, RT-PCR z użyciem zestawu starterów do testu skracania białka27 zastosowano do szybkiego skriningu pod kątem nieprawidłowych zdarzeń splicingu w genie DMD.
Ocena poziomu białka
Do analizy immunofluorescencyjnej, skrawki utrwalone acetonem inkubowano przez 90 minut z monoklonalnymi przeciwciałami przeciw centralnej domenie prętowej (MANDYS106, Dr. G. Morris, Wielka Brytania) w rozcieńczeniu 1:60, C-końcowa domena (NCL-DYS2 , Novocastra Laboratories) w rozcieńczeniu 1:30 lub (jako odniesienie) lamininie a2 (Chemicon International), podstawowym białku blaszki liściowej, na które nie ma wpływu niedobór dystrofiny, w rozcieńczeniu 1: 150, a następnie kozie Alexa Fluor 488 przeciwciało antymonu IgG (H + L) (Molecular Probes) w rozcieńczeniu 1: 250 przez godzinę. Sekcje zostały zamontowane za pomocą Vectashield Mounting Medium (Vector Laboratories)
[przypisy: chirurgia dziecięca warszawa, rehabilitacja warszawa ursynów, usuwanie zębów pod narkozą cena ]