Lokalne odnowienie dystrofiny za pomocą antysensownego oligonukleotydu PRO051 ad 7

M oznacza marker wielkości i kontrolę C. Figura 4. Figura 4. Działanie przywracające dystrofinę pojedynczej dawki domięśniowej PRO051. Analiza immunofluorescencyjna z zastosowaniem przeciwciała dystrofiny MANDYS106 wyraźnie pokazuje ekspresję dystrofiny w błonach większości włókien w całej próbce biopsyjnej pobranej od każdego pacjenta (Panel A). Obszary oznaczone przez kwadraty są pokazane w większym powiększeniu w panelu B. Dla porównania, próbki od nieleczonego pacjenta z dystrofią mięśniową Duchenne a (DMD) i zdrową próbkę kontrolną z mięśnia brzuchatego łydki (HC) są zawarte w próbkach od pacjentów . Włókna reaktywne oznaczone są strzałkami. Całkowitą liczbę włókien mięśniowych, które zawierały dystrofinę i lamininę .2, zliczono ręcznie i wykreślono stosunki dystrofiny do lamininy .2 (panel C). Analiza Western biot całkowitego ekstraktu białkowego wyizolowanego z próbek biopsyjnych pacjentów z użyciem przeciwciała NCL-DYS1 wykazuje przywróconą ekspresję dystrofiny u wszystkich pacjentów (Panel E). Dla każdego pacjenta załadowano 30 .g (prawy pas) i 60 .g (lewy pas); dla porównania, załadowano także 3 .g białka całkowitego ze zdrowej próbki mięśnia brzuchatego łydki (w celu uniknięcia prześwietlenia). Ze względu na stosunkowo niewielkie delecje w genie DMD tych pacjentów, nie zaobserwowano różnic w wielkościach białek. W Pacjent wykryto zakłócony sygnał zakłócenia przenoszenia na ścieżce 60 .g. Aby skorygować zmienną gęstość włókien mięśniowych w różnych przekrojach, całkowity fluorescencyjny sygnał dystrofiny (procent powierzchniowy) w każdej sekcji wykreślono jako stosunek do procentowej powierzchni lamininy .2 (panel D).
W 28 dniu wykonano biopsję leczonego obszaru u każdego pacjenta. Całkowite RNA mięśniowe izolowano z seryjnych przekrojów w całej próbce biopsyjnej. U wszystkich pacjentów RT-PCR zidentyfikował nowy, krótszy fragment spowodowany pomijaniem egzonu-51, co potwierdzono przez sekwencjonowanie (Figura 3). Dalsza analiza transkryptu nie wykazała żadnych innych zmian (dane nie pokazane). Analiza immunofluorescencyjna przekrojów w całej próbce biopsyjnej każdego pacjenta wykazała wyraźne sarcolemalne sygnały dystrofiny w większości włókien mięśniowych (Figura 4A i 4B). Przeciwciała dystrofiny proksymalnie i dystalnie do delecji, które stosowano, obejmowały MANDYS106 (Figura 4A i 4B) i NCL-DYS2 (podobne do MANDYS106, nie pokazane). Włókna w każdej sekcji zostały ręcznie policzone po wybarwieniu dla lamininy .2,30. Poszczególne liczby różniły się, zgodnie z rozmiarem próbki biopsyjnej i jakością mięśnia. W największych przekrojach, Pacjent 2 miał 726 włókien, z których 620 było dodatnich pod względem dystrofiny, podczas gdy Pacjent 3 miał 120 włókien, z których 117 było dodatnich pod względem dystrofiny (Figura 4A i 4C). Intensywność dystrofin była zazwyczaj niższa niż w zdrowej próbce z biopsji mięśni (Figura 4B). Pojedyncze włókna z bardziej intensywnym sygnałem dystrofiny u Pacjentów 2 i 3 mogą być włóknami reaktywnymi (Figura 4B).
Analiza Western blot potwierdziła obecność dystrofiny w różnych ilościach (Figura 4E). Sygnały dystrofiny skanowano i korelowano z kontrolą (na mikrogram białka całkowitego). Ilości wahały się od 3% u Pacjenta 3, który miał najbardziej dystroficzny mięsień, do 12% u Pacjenta 2, który miał najlepiej zachowane mięśnie
[więcej w: urolog ciechanów, olej ryżowy włosy, ginekolog na nfz wrocław ]