Lokalne odnowienie dystrofiny za pomocą antysensownego oligonukleotydu PRO051 ad 5

Oprogramowanie ImageJ (W. Rasband, National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij) zostało wykorzystane do ilościowej analizy obrazu, jak opisano wcześniej.28,29 Całe przekroje zostały podzielone na serie od 6 do 10 sąsiednie obrazy, w zależności od wielkości sekcji. Aby zapewnić wiarygodne pomiary, w ciągu jednej sesji wykonano barwienie skrawków i rejestrację wszystkich obrazów przy użyciu stałych ustawień ekspozycji i uniknięcia nasycenia pikseli. Próg o mniejszej intensywności ustalono w tle dla dystrofii mięśniowej Duchenne a i zmierzono dodatnią fluorescencję dla każdej sekcji (procent powierzchni), zarówno dla dystrofiny jak i lamininy .2. Analizę Western blot przeprowadzono jak opisano uprzednio19 przy użyciu połączonych homogenatów z zestawów czterech seryjnych przekrojów 50 .m w całej próbce biopsyjnej. Dla każdego pacjenta zastosowano dwie ilości białka całkowitego – 30 .g i 60 .g -, a dla próbki kontrolnej 3 .g. Western blot inkubowano przez noc z przeciwciałem monoklonalnym dystrofiny NCL-DYS1 (Novocastra Laboratories) w rozcieńczeniu 1: 125, a następnie wyznakowanym chrzanowo-peroksydazowym kozim antymouse IgG (Santa Cruz Biotechnology) w rozcieńczeniu 1: 10 000 przez godzinę. . Immunoreaktywne prążki wizualizowano za pomocą systemu detekcji Western blot ECL Plus (GE Healthcare) i Hyperfilm ECL (Amersham Biosciences). Natężenia sygnału zmierzono za pomocą oprogramowania ImageJ.
Wyniki
Wstępne oznaczanie pacjentów
Rysunek 2. Rysunek 2. Badania wstępne czterech pacjentów. Rezonans magnetyczny kończyn dolnych czterech pacjentów (lewa noga pacjenta 3 i prawe nogi pozostałych trzech pacjentów) wykazuje odpowiedni stan mięśnia piszczelowego przedniego (mniej niż 50% nacieku tłuszczu i włóknienie) (panel A) . Rozpoznanie dystrofii mięśniowej Duchenne a u tych pacjentów zostało potwierdzone przez czterochlorowodorek diaminobenzydyny w przekrojach próbek biopsyjnych uzyskanych wcześniej z mięśnia czworogłowego (Panel B). Nie obserwowano ekspresji dystrofiny, z wyjątkiem jednego, dodatniego lub dystrofiny, błonnika u Pacjenta 2 (strzałka). Analiza reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkryptazą (RT-PCR) regionu transkrypcyjnego otaczającego mutacje pacjentów i eksonu 51 potwierdziła zarówno indywidualne mutacje w nieleczonych miotubulach (NT), jak i pozytywną odpowiedź na PRO051 (tj. Pominięcie egzonu 51). ) w leczonych miotubach (T) na poziomie RNA (panel C). Wydajność pominięcia egzonu wyniosła 49% dla Pacjenta 1, 84% dla Pacjenta 2, 58% dla Pacjenta 3 i 90% dla Pacjenta 4. Ukryte miejsce splicingowe w eksonie 51 jest czasami aktywowane przez PRO051 w hodowli komórkowej, dając w wyniku dodatkowy nieprawidłowy produkt do składania, jak widać w traktowanej próbce od Pacjenta 4. Ścieżka M pokazuje marker wielkości 100 pz i RNA ścieżki C od zdrowego kontrolnego mięśnia. Analiza sekwencji fragmentów RT-PCR z traktowanych i nietraktowanych myotubów zidentyfikowała dokładne pomijanie egzonu 51 dla każdego pacjenta (Panel D). Nowe transkrypty w ramce doprowadziły do znacznej syntezy dystrofiny, co wykryto za pomocą analizy immunofluorescencyjnej traktowanych myotubów przy użyciu przeciwciała monoklonalnego NCL-DYS2 (panel E)
[hasła pokrewne: chirurgia dziecięca warszawa, cystektomia, poradnia rehabilitacyjna dla dzieci ]