Ekspresja endoteliny-1 w płucach pacjentów z nadciśnieniem płucnym cd

Dodatkowe wycinki z każdej próbki barwiono hematoksyliną i eozyną w celu oceny patologicznej zgodnie z systemem Heatha i Edwardsa18. Hybrydyzacja In Situ
Skrawki kriostatu o 10 mikrometrach z tkanek utrwalonych w paraformaldehydzie uwodniono w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, przepuszczono przez proteinazę K i zanurzono w 4% paraformaldehydzie na pięć minut, aby zatrzymać reakcję. Po trzech przemyciach w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, sekcje zanurzono w roztworze trietanoloaminy (0,1 mol na litr) i bezwodnika octowego (0,25 mol na litr) przez 10 minut, odwodniono w etanolu i wysuszono na powietrzu. Skrawki hybrydyzowano z sondą RNA komplementarną wobec preproendoteliny-1 (cRNA) znakowaną siarką-35 (1 x 106 cpm na sekcję) przez 16 godzin w 42 ° C14. Niezwiązaną sondę cRNA usunięto przez inkubację w roztworze RNazy (20 .g na mililitr) przez 30 minut w 42 ° C w 2 × roztworze soli cytrynianu sodu (SSC; × SSC to 0,15 mola chlorku sodu i 0,015 mola cytrynianu sodu na litr, pH 7). Następnie przeprowadzono kolejne przemywania w stopniowanych stężeniach SSC (od 2 x SSC do 0,1 x SSC) w temperaturach w zakresie od 20 ° C do 55 ° C. Autoradiogramy były eksponowane w szczelnie zamkniętych pudełkach przez 5 do 10 dni w temperaturze 4 ° C, opracowane w wywoływaczu D-19 (Kodak, Rochester, NY), utrwalone, barwione kontrastowo hematoksyliną, odwodnione i zamontowane. Sekcje płuca hybrydyzowane z sondą sensowną lub skrawkami traktowanymi roztworem RNazy przed hybrydyzacją były stosowane jako kontrole negatywne do określania specyficzności sygnałów hybrydyzacji.
Jednoczesna lokalizacja mRNA i peptydu Endoteliny-1
Aby zbadać, czy immunoreaktywność typu endoteliny-1 była zlokalizowana w komórkach, które wyrażały mRNA preproendoteliny-1, sekcje kriostatu zostały ponownie uwodnione w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, stały się przepuszczalne w proteinazie K przez siedem minut, zanurzone w 4% paraformaldehydzie i przemyte w sól fizjologiczna buforowana fosforanem. Następnie sekcje hybrydyzowano ze znakowaną radioaktywnie sondą cRNA preproendoteliny-1 i przemyto jak opisano powyżej. Po ostatnim płukaniu w 0,1 x SSC, skrawki przepłukano solą fizjologiczną buforowaną fosforanami i wybarwiono immunologicznie surowicą odpornościową endoteliny-1 jak opisano powyżej, a następnie poddano obróbce do autoradiografii. Powyższa metoda była modyfikacją opisaną przez Hoeflera i wsp. 23.
Analiza Northern Blot
W analizie Northern blot całkowity RNA ekstrahowano z tkanki płucnej od pacjentów z pleksogenną arteriopatią płuc (grupa 1) i pacjentów z wtórnym nadciśnieniem płucnym (grupa 2) oraz z niewykorzystanej prawidłowej tkanki płucnej dawców narządów. Metoda ekstrakcji RNA i hybrydyzacji została opisana w innym miejscu24.
Analiza statystyczna
Wyniki przedstawiono jako średnie . SE. Istotność różnic między grupami została oceniona za pomocą dwustronnego testu rangi podpisu Wilcoxona, a poprawka Bonferroniego została zastosowana dla potrzeb wielokrotnych porównań25. Opór naczyń płucnych obliczono w jednostkach drewna (średnie płucne ciśnienie tętnicze pomniejszone o ciśnienie zaklinowania w tętnicy płucnej w milimetrach słupa rtęci podzielone przez pojemność minutową serca w litrach na minutę), a całkowitą oporność płucną obliczono jako średnie tętnicze ciśnienie płucne podzielone przez rzut serca
[patrz też: krew oddawanie, leki od a do z, leukoencefalopatia ]